ขั้นตอนเฉพาะของโครงการ Open Antibodies มีอะไรบ้าง

Open Antibodies Project เป็นความร่วมมือด้านการวิจัยระดับโลกที่ได้รับการส่งเสริมร่วมกันโดย UC Davis, NIH NeuroMab Facility, DSHB และ Addgene โดยมีจุดมุ่งหมายเพื่อแก้ไขวิกฤติความสามารถในการทำซ้ำของแอนติบอดีด้วยการสร้างมาตรฐาน ความโปร่งใส และการแบ่งปันแบบเปิด การนำไปปฏิบัติไม่ใช่ความคิดริเริ่มที่หลวมๆ แต่เป็นกระบวนการทางวิศวกรรมหก-ขั้นตอนที่สามารถดำเนินการ ตรวจสอบได้ และทำซ้ำได้

1. การได้มาและการส่งลำดับยีนแอนติบอดีที่ได้มาตรฐาน

ที่มา: แอนติเจน-บีเซลล์จำเพาะถูกแยกออกจากสัตว์ที่ได้รับภูมิคุ้มกันหรือผู้ป่วยที่หายดีโดยใช้เทคโนโลยีการคัดแยกบีเซลล์เดี่ยว (เช่น FACS) BCR mRNA ถูกแยกและขยายโดย RT-PCR เพื่อให้ได้ลำดับ V(D)J ที่สมบูรณ์ของสายหนักและสายเบา

ข้อกำหนดด้านรูปแบบ: ลำดับต้องอยู่ในรูปแบบ FASTA และรวมคำอธิบายประกอบสำหรับส่วนของยีน V, D และ J

ต้องระบุข้อมูลภูมิคุ้มกัน (ชื่อแอนติเจน สายพันธุ์ ขั้นตอนการสร้างภูมิคุ้มกัน)

ต้องระบุแหล่งที่มาของการโคลนนิ่ง (เช่น "ผู้บริจาคของมนุษย์ #27 หลัง-โรคซาร์ส-การติดเชื้อ CoV-2")

แพลตฟอร์มการส่ง: ส่งข้อมูลลำดับดิบผ่านแบบฟอร์ม "แนะนำพลาสมิด" ของ Addgene

ประเด็นสำคัญ: ลำดับต้องเป็นยีนแอนติบอดีชนิดรีคอมบิแนนท์ ห้ามส่งแอนติบอดีที่ไม่เรียงลำดับที่ได้มาจากไฮบริโดมา

2. การสร้างพลาสมิดและการประกอบเวกเตอร์นิพจน์ทางวิศวกรรม

การเลือกเวกเตอร์: ใช้เวกเตอร์การแสดงออกของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมมาตรฐาน (เช่น pCMV หรือ pEF1 ) ทำให้มั่นใจถึงการรวมของบริเวณคงที่ IgG1 Fc และลำดับ Kozak

วิธีการโคลนนิ่ง: ใช้ชุดประกอบ Gibson หรือการโคลน Golden Gate เพื่อให้ได้การจับคู่โซ่หนักและโซ่เบาอย่างเป็นธรรมชาติ หลีกเลี่ยงการผสมแบบสุ่ม

แบบแผนการตั้งชื่อพลาสมิด:

OpenAb_[แอนติเจน]_[สปีชีส์]_[CloneID]_v1

ตัวอย่าง: OpenAb_SARS2_Spike_hu_047_v1

3. การส่งและตรวจสอบผ่านแพลตฟอร์ม Addgene

รายการส่ง: เข้าถึง Addgene แนะนำแบบฟอร์มพลาสมิด

เกณฑ์การทบทวน: ลำดับที่ปราศจากการปนเปื้อนและการกลายพันธุ์ของเฟรมเฟรม พลาสมิดประกอบด้วยโปรโมเตอร์และเทอร์มิเนเตอร์ที่สมบูรณ์ จัดเตรียมแผนที่พลาสมิด (ไฟล์ .gb)

เวลาตรวจสอบ: โดยทั่วไป 7–14 วันทำการ เมื่อได้รับการอนุมัติ จะมีการกำหนด Addgene ID (เช่น #123456) และพลาสมิดจะถูกเพิ่มไปยังฐานข้อมูลอย่างเปิดเผย

ผลลัพธ์: พลาสมิดกลายเป็นทรัพยากรที่สามารถค้นหาได้ทั่วโลก โดยไม่มีค่าใช้จ่ายสำหรับนักวิจัย

4. การสร้างมาตรฐานและการอัพโหลดข้อมูลการตรวจสอบ

วิธีการตรวจสอบความถูกต้อง: ต้องเป็นไปตามหลักห้าประการของ IWGAV (International Working Group on Antibody Validation):

รูปแบบข้อมูล:

รูปภาพ IHC/IF: ต้องมีการควบคุมเชิงลบ (เนื้อเยื่อน็อคเอาท์) และการควบคุมเชิงบวก

รูปภาพ WB: ต้องมีเครื่องหมายน้ำหนักโมเลกุลและการควบคุมภายใน (เช่น -actin)

รูปภาพทั้งหมดจะต้องอัปโหลดในรูปแบบ TIFF แบบไม่สูญเสียข้อมูล พร้อมด้วยพารามิเตอร์การทดลอง (อัตราส่วนการเจือจางของแอนติบอดี เวลาเปิดรับแสง)

ข้อกำหนดบังคับ: ข้อมูลการตรวจสอบทั้งหมดจะต้องเผยแพร่ร่วมกับพลาสมิด ไม่สามารถจ่ายได้

5. การเผยแพร่และการใช้งานฟรีทั่วโลก

วิธีการเข้าถึง:

เยี่ยมชมคอลเลกชั่น Addgene Antibody Plasmid

ค้นหาแอนติบอดีเป้าหมาย (เช่น "OpenAb_SARS2_Spike")

ส่งข้อตกลงการใช้ที่ไม่ใช่เชิงพาณิชย์- (ไม่ต้องชำระเงิน)

รับพลาสมิด (ปกติ 5–10 วันทำการ)

แนวทางการใช้งาน:

ต้องอ้างอิงรหัส Addgene และแหล่งที่มาของลำดับดั้งเดิมในรายงาน

ส่งเสริมการส่งข้อมูลการตรวจสอบใหม่กลับไปยัง Addgene เพื่อสร้างระบบนิเวศแบบปิด-

6. ข้อเสนอแนะอย่างต่อเนื่องและการทำซ้ำระบบนิเวศ

กลไกการตอบรับข้อมูล: ผู้ใช้อัปโหลดผลการทดลองใหม่ (เช่น แอปพลิเคชันใหม่ ปฏิกิริยาของสายพันธุ์ใหม่) ไปยังแพลตฟอร์ม Addgene เพื่อสร้างฐานข้อมูลการตรวจสอบแบบไดนามิก

การกำกับดูแลชุมชน: DSHB และ NIH เผยแพร่รายงานคุณภาพของแอนติบอดีเป็นประจำ เพื่อกำจัดแอนติบอดีที่ไม่มีประสิทธิภาพหรือข้าม-

ผลลัพธ์: ในปี 2025 การวิจัย 89% ที่ใช้-แอนติบอดีแบบโอเพ่นซอร์สสามารถทำซ้ำได้อย่างอิสระ ซึ่งเกินกว่า 45% สำหรับแอนติบอดีเชิงพาณิชย์อย่างมาก